企业等级: | 普通会员 |
经营模式: | 商业服务 |
所在地区: | 湖北 武汉 |
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公司地址: | 湖北省武汉市江夏区神墩四路666号武汉国英种子A栋1楼 |
癌组织原位杂交实验步骤:
1. 将准备做原位杂交的样本常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。
2. 玻片的处理:一般采用多聚赖氨酸或APES。
3. 石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O2 1份+蒸馏水10份混合,室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。
4. 暴露mRNA核酸片段:切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶,混匀),37℃或室温消化3--30分钟(视标本新旧、厚薄自行调整)。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
菌落的裂解及DNA结合于纤维素滤膜
(1) 在一张保鲜膜上制作一个装有0.5mol/L NaOH的小洼(0.75ml),使菌落面朝上,将滤膜放到小洼上,展平保鲜膜,使滤膜均匀湿润,让滤膜留于原处2-3分钟。
(2) 用干纸巾从滤膜的下方吸干滤膜,用一张新的保鲜膜和新配制的0.5mol/L NaOH重复步骤(1)。
(3) 吸干滤膜,将滤膜转移到新的带有1mol/L Tris·Cl(pH7.4)的保鲜膜洼上。5分钟后吸干滤膜,再重复一次该步骤。
(4) 吸干滤膜,把它转移到有1.5mol/L NaCl、0.5mol/L Tris·Cl (pH7.4)的保鲜膜小洼上5分钟后吸干滤膜,转移到一张干的滤纸上,置于室温20-30分钟,使滤膜干燥。
(5) 将滤膜夹在两张干的滤纸之间,在真空烤箱中于80℃干烤2小时,固定DNA。
(6) 将固定在膜上的DNA与32 P标记的RNA进行杂交。